今天喆圖小編就來說說利用蛋白質分離純化方法,從枯草芽孢桿菌中分離出纖維素酶,將其分別作用于羧甲基纖維素(CMC)和濾紙,其生成的還原性糖能和3.5--二硝基水楊酸(DNS)反應生成棕紅色物質,利用分光光度法測出纖維素酶的活性強度。
纖維素酶
濾紙?zhí)?strong> ———— 纖維二糖、葡萄糖等還原性糖 +DNS ———— 棕紅色物質
所需藥品材料:氫氧化鈉、葡萄糖、3.5--二硝基水楊酸(DNS)、硝酸、冰醋酸、醋酸鈉、酒石酸、濾紙、纖維素酶制劑。
試驗需用儀器:分光光度計、電熱恒溫水浴鍋、鼓風干燥箱、分析天平
實驗設計:
一、實驗前期準備工作:
1、醋酸-醋酸鈉緩沖液的配制:量取冰醋酸6ml,定容至1000ml,制成0.1mol/L醋酸溶液。 稱取8.2g醋酸鈉,溶解后容至1000ml,制成0.1mol/L醋酸鈉溶液。使用時以4:6的比例混合,放入低溫保存箱中冷藏備用。
2、葡萄糖溶液的配制:將葡萄糖在鼓風干燥箱中105℃下干燥至恒重,準確稱取100mg 于100mL 小燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,移入100mL 容量瓶中用蒸餾水定容至100mL,充分混勻。
3、3.5--二硝基水楊酸的配制:準確稱取DNS 6.3g于500mL 大燒杯中,用少量蒸餾水溶解后,加入2mol/L NaOH 溶液262mL,再加到500mL 含有185g 酒石酸鉀鈉(C4H4O6KNa · 4H2O,MW=282.22)的熱水溶液中,再加5g結晶酚(C6H5OH,MW=94.11)和5g無水亞硫酸鈉(Na2SO3,MW=126.04),攪拌溶解,冷卻后移入1000mL 容量瓶中用蒸餾水定容至1000mL,充分混勻。
4、葡萄糖標準曲線的繪制:取8支洗凈烘干的25mL 具塞刻度試管,編號后依次加入0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml 1.2ml1.4ml葡萄糖標準溶液,然后用蒸餾水分別定容至2.0ml。配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后,向各試管中加入1.5mL DNS溶液,搖勻后放入水浴鍋中沸水浴5min,取出冷卻后用蒸餾水定容至25mL,充分混勻。在540nm 波長下,以1號試管溶液作為空白對照,調零點,測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標,以對應的光密度值為縱坐標,在坐標紙上繪制出葡萄糖標準曲線。
二、濾紙對實驗的影響分析:由于濾紙中也含有一定量的還原性糖,所以試驗中應該排除底物對實驗的影響。稱取等量碾碎的濾紙與DNS充分反應,測其OD值。
三、酶促反應時間的研究:酶的反應時間不同,其產物濃度也不一樣。依次取反應時間為0min 2min 4min 6min 8min 10min 12min14min的反應體系,加入DNS充分顯色測其OD值。
四、DNS試劑量的確定:DNS本身也具有一定的顏色,如果過量也會對實驗結果造成影響,所以應該設計實驗確定DNS的加入量。取相同酶反應體系,分別加入0.3ml 0.6ml 0.9ml 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml顯色劑DNS充分顯色,測其OD值。
五、吸收波長的確定:取450nm-590nm波長段,以每20nm一個區(qū)段,分別測其OD值,分析結果。
六、沸水浴顯色時間的確定:取相同酶反應體系,DNS沸水顯色分別取1min 3min 5min 7min 9min 11min 13min 15min的OD值,分析結果。
七、顯色后吸光度穩(wěn)定性的研究:分別測量反應體系顯色后15min 20min 25min 30min 35min 40min 45min 50min的吸光度,分析結果。
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